Os lycans (lobisomens) e vampiros vivem espalhados e não solitários, como são retratados costumeiramente. Essas mesmas raças vivem em constantes conflitos, apesar dos lycans estarem em menor número por serem caçados pelos vampiros. Uma dessas caçadoras é Selene (Kate Beckinsale), que os mata como vingança pelo que fizeram supostamente à sua família. Apesar da guerra ter sido terminada há muitos anos, as batalhas continuaram.
A vampira Selene resolve investigar seus inimigos imortais e descobre que eles estão atrás de um médico humano, Michael Corvin (Scott Speedman), assim ela também desconfia que Kraven (Shane Brolly), o atual comandante do Coven dos vampiros, esteja planejando uma conspiração com Lucian (Michael Sheen), líder dos lycans, contra Viktor (Bill Nighy) o verdadeiro comandante do Coven que está em hibernação.
Além desse principal conflito, aparece o triângulo amoroso dos vampiros, como a ambição de Erika (Sophia Myles) por Kraven, querendo ser sua rainha e ter poder no Coven, mas infelizmente ela fica para trás pois ele é obcecado por Selene, que o rejeita e acaba se apaixonando pelo médico humano.
Selene é uma personagem fictícia da saga Underworld. É a protagonista da saga até o segundo filme (Underworld: Evolution), pois o terceiro (Underworld: Rise of the Lycans) é apenas uma volta ao passado, quando a guerra entre vampiros e lycans começou, e toda a atenção era levada para a vampira Sonja e o lycan Lucian.
Selene é uma caçadora vampira no meio da guerra entre as duas espécies, perdeu a família há anos, todos mortos por o que ela pensava serem os lycans, mas na verdade ser Viktor, um dos mais antigos anciãos dos vampiros, que quebrava suas regras e se alimentava secretamente de humanos. Quando Viktor encontrou Selene em seu quarto, após matar o resto da família, resolveu transformá-la em vampira pela semelhança com sua filha morta, Sonja.
Selene, pensando que os lycans haviam assassinado sua família, resolve vingar-se matando um por um todas as noites, sob a proteção de seu "pai", Viktor.
No começo do filme, Selene descobre uma conspiração entre os lycans e Kraven, um vampiro que havia supostamente matado Lucian, o rei dos lycans, a seis séculos antes. Depois, a vampira descobre uma ligação com um humano nessa conspiração, que estava sendo perseguido secretamente pelos lycans. Sem saber quem é o humano, Selene escapa da mansão onde mora e vai até o apartamento do humano, chamado Michael.
Na mesma noite, Michael é perseguido pelos lycans em seu prédio e é mordido pelo líder deles, que logo descobre-se ser Lucian, que nunca havia morrido. O resto do filme é concentrado em descobrir que ligação o humano mantém com o mundo dos lycans e dos vampiros.
